2023-10-30

透射电镜样品制备技术之生物样品制备流程

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透射电镜常用的50-100 kV电子束来说，样品的厚度控制在10～100 nm为宜。由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，需要把标本切成厚度小于0.1 µm以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片(Ultrathin sectioning)。常用的超薄切片厚度是50-70 nm，也可进行冷冻超薄切片。

超薄切片技术是为透射电子显微镜观察提供薄样品的专门技术，研究材料类、生物类样品的基本技术，尤其是观察细胞、组织、器官等的超微结构以及亚细胞结构常用的技术。也是电镜细胞化学、免疫电镜等技术的关键性技术。它在生物学的发展过程中占据重要的地位，目前各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是由它提供的。



制备流程
取材→固定→脱水→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（生物类）

取材→清洗→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（材料类）

生物样品超薄切片要求：

（1）细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应；
（2）切片厚度50-100 nm为宜：太薄反差低；太厚反差好，但结构重叠，电子束不能穿透；

（3）切片应耐电子束的强烈照射，不变形不升华；

（4）切片能够适当被染色，保证一定的反差；

（5）切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀。

取材
目地和要求:

（1）新鲜。(材料离体后1-5 min内进入固定液，避免细胞自溶和结构变化)

（2）体积小。(厚度<1 mm，长度宽度均<5 mm，固定液渗透能力有限，组织太大会导致无法固定充分）

（3）机械损伤小。(动作轻巧，器械锋利，避免对组织的挤压和推拉，建议用剃须刀片、手术刀片、手术剪刀。)

（4）低温操作，器械、容器、固定液均需预冷（降低酶的活性，减少组织自溶）。

（5）取材部位准确，且注意材料的方向性和定位。

固定
目的和要求：终止组织细胞的生化过程同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内，并保护这些结构在后续的脱水、包埋等过程中不被破坏；将蛋白、离子等内容物保留在原位，以便后续的研究。

固定液：固定剂＋缓冲液
（1）破坏细胞的酶活性系统

（2）稳定细胞物质成分，并保存之

（3）接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀

（4）在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型

（5）提供一定的电子反差

固定剂：
戊二醛（C5H8O2)：渗透性好，保存蛋白质、酶活性，稳定糖元，无电子染色作用，固定脂类和膜差。可长时固定（低温可达半年）。

锇酸（OsO4)：强氧化剂，固定脂类、膜结构，有电子染色作用；破坏酶活性。

多聚甲醛：优良地保存酶活性，用于细胞化学。

缓冲液：仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护。维持稳定的pH值；提供适当的渗透压；提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀。

固定方法：常用双固定法，用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定。
影响因素：
    1.pH值：动物组织7.2-7.4，植物6.8-7.0，高度含水组织8.0-8.4

    2.缓冲液类型：磷酸缓冲液、二甲砷酸盐缓冲液等，0.05-0.1 mol/L

    3.渗透压：KCl, NaCl, 蔗糖调节

    4.固定剂浓度：戊二醛2-6%，四氧化锇1-2%

    5.材料大小：0.5-1 mm³

操作步骤：

戊二醛固定液：有细胞壁的样品5%，无细胞壁样品3%。加入缓冲体系，确保生物样本内外渗透压，避免细胞萎缩或吸涨。

切取一小块组织，置入预冷的戊二醛固定液（3-5%）中，4℃预固定20分钟后，捞出置于洁净的保鲜膜或培养皿上（已滴有预冷的固定液），在固定液中用将组织切成2-5 mm长， 2-3 mm宽， 1 mm厚的细条，移入盛有预冷的戊二醛固定液的离心管中，4 ℃固定过夜。
1.植物细胞的细胞壁和液泡会阻碍固定液迅速渗入。植物材料内部存有的空气，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影响到植物组织的固定效果。组织放入戊二醛固定液后，可用真空泵抽出组织内部的气体，使材料沉入固定液中。
2.动物样本的取材，可将动物麻醉或急性处死后切取组织。或者采用原位固定、流灌固定后再切取所需组织。

3.细胞培养的样品，轻微并短暂离心，倒净培养液后，加入预冷的固定液，4℃固定10 min后，低温6000 rpm/min离心5 min（离心力不可过大，离心时间不可过长，避免机械挤压），去上清，滴加新鲜固定液并重悬，4℃固定过夜。

脱水
用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分，使之能与包埋剂混合。
要求：脱水要彻底；更换液体动作要迅速；脱水时间不宜过长；固定后的样品要充分漂洗。
脱水剂：乙醇、丙酮、环氧丙烷等。
步骤：逐级梯度脱水
30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步骤每次15-20 min)→100％(2-3次，每次15 min)→100％丙酮(20 min) 

包埋
1.渗透：用包埋剂或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙被渗透液填充，使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合。
包埋剂：聚合有良好的切割性能，软硬度易调节粘度低，易渗透；溶于脱水剂；电子透明度好，并具有一定的反差，聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低；本身无结构，热稳定性好，可耐电子束轰击；来源丰富，且各批号性能尽可能一致；切片易染色,且对人体无害。
常用Epon 812、Spurr、LR white等

步骤：逐级梯度渗透，脱水剂:包埋剂3:1 → 1:1 → 1:3 →纯包埋剂
2.包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋。
3.聚合：加温聚合形成固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，制成适于机械切割的固体包埋块，利于切片。

步骤：37℃(12 h)→45 ℃(12-48 h)→60 ℃(24-48 h)

超薄切片
制刀：常用玻璃刀、钻石刀。刀上要装水槽，并注入槽液。
槽液要求：不与材料发生化学反应，干净无杂质；液面与刀口基本平行；低粘度,蒸发量小；有一定的表面张力,有利于漂浮切片。
常用的槽液：双蒸水、二甲基亚砜（DMSO）、甘油水溶液等。
修块：除去组织周围多余的包埋介质和不感兴趣的部分，以提供较大的有效观察面积。并修成一定形状、大小的包埋块截面，便于连续切片。
可手工、机械修块。

切片：装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片
注意事项：对刀是关键；槽液用新鲜溶液；温度20~25℃，相对湿度60%；室内无空气流动，清洁，防止震动；刀槽密封，否则漏水。
电子染色
利用高密度的重金属染色剂（铅、铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差的方法。
染色实质上是增大电子密度，电镜图像灰度不同。电子显微镜图片均为黑白灰，无彩色。
常用染色剂：
醋酸铀：主要染核酸、核蛋白、细胞核、结缔组织。要避光，有微弱的放射性

柠檬酸铅：主要染膜结构、脂类、核酸。易与CO2反应成沉淀，染色中应避免。

步骤：单染：铅盐单染,铀盐单染。

双染色：醋酸双氧铀染色→漂洗→柠檬酸铅染色→漂洗→干燥。双染色较为常用。
材料样品取材后可用丙酮清洗样品表面，直接包埋（渗透、包埋、聚合），超薄切片、电子染色（锇酸熏染）。

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